Difetto Critico.Esperimento1 .Cani Beagle maschi(Greenhill, Montichiari, Italy) sono stati preparato chirurgicamente creando un difetto critico di un segmento di 1.5-cm usando una sega oscillatoria secondo pratiche chirurgiche veterinarie accetate. Il radio e la rimanente membrana interossea sono state lasciate intatte , e i tessuti molli sono stati chiusi in punta. Gli animali sono stati divisi in tre gruppi sperimentali (n = 8 per gruppo)e trattati con tre (Groppo A), sette (Gruppo B), o 14 (Gruppo C) iniezioni giornaliere di una soluzione acquosa di CP-533,536 [100 mg/ml in PBS calcio privo di magnesio dopo l'intervento e l'impianto di Helistat (2.5 נ5 cm) spugne di collagene pretagliate nell'area difettata , Colla-Tec, Plainsboro, NJ]. Le radiografie delle zampe anteriori immediatamente ottenute dopo l'intervento e dopo due settimane fino al termine dello studio (settimana 10).
Esperimento 2. In un altro set di esperimenti su difetti critici dell'ulna, cani beagle maschi (n = 28), preparati chirurgicamente come sopra, sono stati divisi in quattro gruppi e trattati con 1.0 ml of poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGH) matrix (Atrix Laboratories) ds dolo (Gruppo A), 50 mg di CP-533,536 dissolto in 1.0 ml di matrix (Gruppo B), 10 mg of CP-533,536 dissolto in 1.0 ml di matrix (Groppo C), o 10 mg di CP-533,536 dissolto in 0.2 ml di matrix (Groppo D). In questi esperimenti,nessuna spugna pretagliata di collagene experiments, sono state usate nell'area difetatta. Il composto è stato somministrato in singole dosi nell'intervento. Il sangue(1.0 ml) è stato raccolto dagli animali ogni 30 min, 2 h, 4 h, 24 h, 72 h, e 7 giorni dopo l'intervento.Gli animali sono stati monitorati nel post operatorio per gli effetti collaterali ,e le radiografie degli arti anteriori sono state ottenute immediatamente dopo l'intervento ed ogni settimana fino al termine dello studio (settimana 24).
Osteotomia della Tibia . Per il modello dell'osteotomia della tibia,cani beagle maschi (n = 14) sono stati preparati mediante un'osteotomia chirurgica sulla porzione distale della tibia del cane usando una sega Gigli secondo pratiche veterinarie chirurgiche accertate. I segmenti di osso prossimali e distali sono stati stabilizzati usando una placca AO . La rimanente membrana interossea è stata lasciata intatta. Il sito difettato è stato irrigato con soluzione salina per rimuovere detriti di ossa e riempito con PLGH matrice da sola o matrice contenente CP-533,536 nella maniera seguente: Gruppo A, i cani sono stati lasciati senza trattamento (n = 3); Gruppo B, i cani sono stati trattati con 0.5 ml di sola matrice (n = 3); Gruppo C, i cani sono stati trattati con 5 mg di CP-533,536 disciolti in 0.5 ml di matrice (n = 4); e Gruppo D, i cani sono stati trattati con 25 mg of CP-533,536 disciolti in 0.5 ml di matrice (n = 4). Il sangue (1.0 ml) è stato raccolto dagli animali ogni 30 min, 2 h, 4 h, e 24 h dopo l'intervento. Le radiografie delle zampe anteriori sono state ottenute immediatamente dopo l'intervento e ogni settimana fino al termine dello studio (settimana 8).
Radiografie. Le radiografie sono state interpretate da un radiologo sperimentatore tenuto all'oscuro del protocollo di trattamento e dell'intervallo postoperatorio . Sono state classificate su una scala da 0?6come descritto da Cook et al. (ref. 24; see Table 3).
Istologia . In conclusione,nel modello di difetto dell'ulna o osteotomia della tibia, le ossa contenenti il sito difettato sono state dissezionate e i muscoli rimossi . Il sito difettato dell'osso con l'osso adiacente è stato tagliato con una sega , fissate in una soluzione neutra per il 10% trattata con formalina per sette giorni ,e poi incorportato in metacrilato metilico . Sezioni seriali sono state tagliate attraverso ogni area difetatta e tinte con toluidina blue and roso base 2 verde (23).
Analisi di CP-533,536 nel Plasma. [....]
Si prosegue parlando di analisi statistiche...
Critical Defect. Experiment 1. Male beagle dogs (Greenhill, Montichiari, Italy) were surgically prepared by creating a 1.5-cm segmental critical defect in the midulna by using a pendular saw according to accepted veterinary surgical practices. The radius and remaining interosseal membrane were left intact, and the soft tissues were closed in layers. Animals were divided into three experimental groups (n = 8 per group) and treated with three (Group A), seven (Group B), or 14 (Group C) daily injections of an aqueous solution of CP-533,536 [100 mg/ml in calcium magnesium-free PBS after surgery and implantation of Helistat (2.5 נ5 cm) precut collagen sponges into the defect area, Colla-Tec, Plainsboro, NJ]. Radiographs of the forelimbs were obtained immediately after surgery and every 2 weeks until termination of the study (week 10).
Experiment 2. In another set of ulnar critical defect experiments, male beagle dogs (n = 28), surgically prepared as above, were divided into four groups and treated with 1.0 ml of poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGH) matrix (Atrix Laboratories) alone (Group A), 50 mg of CP-533,536 dissolved in 1.0 ml of matrix (Group B), 10 mg of CP-533,536 dissolved in 1.0 ml of matrix (Group C), or 10 mg of CP-533,536 dissolved in 0.2 ml of matrix (Group D). In these experiments, no precut collagen sponge was used in the defect area. The compound was administered into the defect area in a single dose at surgery. Blood (1.0 ml) was collected from animals 30 min, 2 h, 4 h, 24 h, 72 h, and 7 days after surgery. Animals were monitored postsurgically for side effects, and radiographs of the forelimbs were obtained immediately after surgery and every week until the termination of the study (week 24).
Tibial Osteotomy. For the tibial osteotomy model, male beagle dogs (n = 14) were prepared by making a surgical osteotomy on the distal portion of the dog tibia by using a Gigli saw according to accepted veterinary surgical practices. The proximal and distal bone segments were stabilized by using an AO plate. The remaining interosseal membrane was left intact. The defect site was irrigated with saline to remove bone debris and filled with PLGH matrix alone or matrix containing CP-533,536 in the following manner: Group A, dogs were left untreated (n = 3); Group B, dogs were treated with 0.5 ml of matrix alone (n = 3); Group C, dogs were treated with 5 mg of CP-533,536 dissolved in 0.5 ml of matrix (n = 4); and Group D, dogs were treated with 25 mg of CP-533,536 dissolved in 0.5 ml of matrix (n = 4). Blood (1.0 ml) was collected from all animals at 30 min, 2 h, 4 h, and 24 h after surgery. Radiographs of the forelimbs were obtained immediately after surgery and every week until the termination of the study (week 8).
Radiographs. Radiographs were interpreted by an experienced radiologist blinded to the treatment protocol and postoperative interval. They were graded on a 0?6 scale as described by Cook et al. (ref. 24; see Table 3).
Histology. On termination, in the ulnar defect or tibial osteotomy model, bones containing the defect site were dissected and muscles removed. The bone defect site with adjacent bone was cut with a saw, fixed in 10% neutral buffered formalin for 7 days, and then embedded in methyl methacrylate. Serial sections were cut through each defect and stained with toluidine blue and safranine O-fast green (23).
Analysis of CP-533,536 in Plasma. Plasma samples were thawed, and 20 of each sample was injected into a PE-Sciex (Thornhill, ON, Canada) API 3000 triple quadrapole mass spectrometer with a turbo ionspray source. A Luna (Phenomenex, Torrance, CA) phenyl-hexyl (4.6 נ50 mm נ3 ) column was used for separation. CP-533,536 and the internal standard were determined in negative ion mode by using multireaction monitoring by following the mass transitions of 467.3/303.2 m/z and 388.3/198.1 m/z, respectively. The linear dynamic range of the assay was from 1 to 2,000 ng/ml. The mean accuracy of the assay characterized with quality control standards was 80?116%.
Statistical Analysis. Statistics were calculated by using STATVIEW 4.0 packages (Abacus Concepts, Berkeley, CA). The ANOVA test was used for all group comparisons, and Fisher's protected least significant difference was used to compare the differences between each group.
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